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分析方法

Ilex guayusaの植物化学分析に関する専門家向けの包括的な方法論的詳細

要点
ポイントまとめ:
  • 概要
  • 試料調製
  • HPLC

    HPLC

    高速液体クロマトグラフィー - グアイウサ中のポリフェノールおよびアルカロイドの定量分析に用いられる標準的手法。典型的な方法はC18カラム、アセトニトリル勾配、280 nmでのUV検出。

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    法
  • LC-MS/MS

    LC-MS/MS

    液体クロマトグラフィー-タンデム質量分析法。二次代謝産物の同定および定量に用いられる高感度分析法。グアイウサのサポニンおよびポリフェノール分析に使用される。

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    法
  • 揮発性化合物のGC-MS

    GC-MS

    ガスクロマトグラフィー-質量分析法 - 揮発性化合物の同定に用いられる分析法。グアイウサの香気成分分析に使用される。

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このページは科学者、分析者、専門家を対象としています。Guayusa成分の分析に関する詳細な方法論的情報が含まれています。

分析方法の概要

Ilex guayusaの植物化学的特性評価には、さまざまな分析技術の組み合わせが必要です。方法の選択は、対象化合物、マトリックス、および必要な感度に依存します。

方法ターゲット化合物LOD分析時間コスト
HPLC-DADポリフェノール、カフェイン0.1-1 μg/mL30-60 min€€
HPLC-DAD-ESI/MSnポリフェノール(構造解明)0.01-0.1 μg/mL45-90 min€€€
LC-MS/MS (QqQ)アルカロイド、サポニン0.001-0.01 μg/mL15-30 min€€€€
GC-MS揮発性化合物0.01-0.1 ng/mL30-45 min€€€
UV-Vis Spectroscopy総ポリフェノール(TPC)1-10 μg/mL5-10 min€
NMR構造解明1-10 mg1-4 h€€€€€

試料調製

試料調製は再現性のある正確な結果を得るために重要です。Guayusaの葉には酸化に敏感なポリフェノールが高濃度で含まれています。

ポリフェノール分析の標準プロトコル (García-Ruiz et al. 2017)

材料

  • Freeze-dried guayusa leaves (ground, <0.5 mm)
  • 抽出溶液: メタノール/水 (70:30, v/v) + 1% ギ酸
  • 0.45 μm PVDF filter (Millex HV13, Millipore)
  • Ultrasonic bath (40 kHz)
  • Centrifuge (9,500 × g)

プロトコル

  1. 秤量: 100 mgの凍結乾燥粉末を15 mLのファルコンチューブに入れる
  2. 抽出 1: 1 mLの抽出溶液を加え、ボルテックス (30秒)
  3. 超音波 1: 室温で超音波浴で60分
  4. インキュベーション: 4°Cで一晩
  5. 超音波 2: 再度超音波浴で60分
  6. 遠心分離: 9,500 × g, 5分, 室温
  7. ろ過: 上清を0.45 μmのPVDFフィルターでろ過
  8. 保存: 4°Cで暗所に、分析前最大48時間

回収率

化合物クラス回収率 (%)RSD (%)
クロロゲン酸類94.2 ± 3.13.3
フラボノール類91.8 ± 4.24.6
カテキン類88.5 ± 5.15.8
カフェイン98.7 ± 1.21.2

カロテノイド抽出 (Stinco et al. 2016)

プロトコル

  1. 秤量: 10 mgの凍結乾燥粉末
  2. 水の除去: 1 mLのMilliQ水を加え、ボルテックス、遠心分離 (18,000 × g, 3分)、廃棄
  3. 抽出 1: 1 mLのヘキサン/アセトン (1:1, v/v)、ボルテックス、遠心分離 (18,000 × g, 3分)
  4. 抽出 2: 500 μLのヘキサン/アセトン、ボルテックス、遠心分離
  5. 統合: 有機相を統合
  6. けん化: メタノール性KOH (30 g/100 mL)、室温で1時間暗所に
  7. 洗浄: 水でpH中性まで
  8. 蒸発: 真空濃縮器、<30°C
  9. 溶解: 100 μLのエチルアセテートに
  10. 保存: N₂下で-20°C

重要な要因

HPLC法

HPLC-DAD für Quantifizierung

ダイオードアレイ検出器を用いた高性能液体クロマトグラフィー text_563はポリフェノールとカフェインの定量化の標準法です。

Instrument Setup (García-Ruiz et al. 2017)

  • システム: Agilent 1220 Infinity LC
  • ポンプ:バイナリグラジエントポンプ
  • オートサンプラー:注入量20 μL
  • カラムオーブン:30°C
  • 検出器:DAD、200-600 nm

クロマトグラフィー条件

パラメータ値
カラムLuna C18 (25 cm × 4.6 mm, 5 μm, Phenomenex)
ガードカラムC18, 4 × 3 mm
移動相AWater + 0.1% Formic Acid
移動相BMethanol + 0.1% Formic Acid
流速1.0 mL/min
注入量20 μL
カラム温度30°C
ランタイム60 min

勾配プログラム

時間 (min)%A (Water)%B (Methanol)
0955
59010
158020
257030
356040
454060
502080
55595
60955

検出波長

化合物クラスλmax (nm)定量波長
ヒドロキシケイ皮酸(クロロゲン酸類)325330 nm
フラボノール類(ケルセチン、ケンフェロール)365360 nm
カテキン類280280 nm
カフェイン272272 nm
アントシアニン(存在する場合)520520 nm

校正

標準物質による外部キャリブレーション：

標準濃度範囲 (μg/mL)R²直線性
クロロゲン酸(5-CQA)1-1000.9998優れた
ルチン(ケルセチン-3-O-ルチノシド)0.5-500.9996優れた
エピカテキン0.5-500.9992優れた
カフェイン5-5000.9999優れた

HPLC-DAD-ESI/MSn für Strukturaufklärung

HPLCと質量分析の結合により、フラグメンテーションパターンを通じて未知の化合物を特定できます。

MSパラメータ (García-Ruiz et al. 2017)

パラメータ値
Mass spectrometerAgilent Ion Trap (G2445A)
IonizationElectrospray (ESI)
ModeNegative ionization
Capillary temperature350°C
Capillary voltage4 kV
Nebulizer pressure65 psi
N₂ flow rate11 L/min
スキャン範囲m/z 100-1200
Collision gasHelium
Collision energy0.3-2.0 V (ramping)

Example: Identification of Quercetin-3-O-hexoside

  • 保持時間:32.4分
  • UVスペクトル:λmax 256、355 nm(フラボノールに典型的)
  • [M-H]⁻: m/z 463
  • MS²(463):m/z 301 [M-H-162]⁻(ヘキソースの損失)
  • MS³(301):m/z 179、151(ケルセチンの典型的なフラグメンテーションパターン)
  • 同定:ケルセチン-3-O-グルコシドまたは-ガラクトシド

Characteristic Fragmentations

化合物クラスCharacteristic Neutral LossesTypical Fragments
クロロゲン酸類-162 (quinic acid), -176 (caffeoylquinic acid)m/z 191 (quinic acid), 179 (caffeic acid)
Quercetin Glycosides-162 (Hexose), -146 (Rhamnose), -308 (Rutinoside)m/z 301 (Quercetin Aglycone)
Kaempferol Glycosides-162 (Hexose), -146 (Rhamnose)m/z 285 (Kaempferol Aglycone)
カテキン類-152 (Gallate)m/z 289 (Epicatechin), 139 (Gallic acid)

LC-MS/MS法 (トリプル四重極)

アルカロイドとサポニンの高感度定量化には、トリプルクアドラポール質量分析計を用いたLC-MS/MSがMultiple Reaction Monitoring (MRM)モードで使用されます。

カフェイン定量(Krieger et al. 2016)

LCパラメータ

パラメータ値
カラムAcquity UPLC BEH C18 (50 mm × 2.1 mm, 1.7 μm)
移動相A0.1% formic acid in water
移動相B0.1% formic acid in acetonitrile
流速0.4 mL/min
注入量5 μL
ランタイム5 min

MS/MSパラメータ (MRMモード)

AnalytePrecursor Ion (m/z)Product Ion (m/z)Collision Energy (eV)LOQ (ng/mL)
カフェイン195.1 [M+H]⁺138.1 (Quantifier)205
カフェイン195.1 [M+H]⁺110.1 (Qualifier)25-
Theobromine181.1 [M+H]⁺138.11810
Paraxanthine (IS)181.1 [M+H]⁺124.122-

方法の妥当性確認

パラメータカフェインTheobromine
直線性 (R²)0.99980.9995
LOD (ng/mL)1.53.0
LOQ (ng/mL)5.010.0
日内精度 (RSD%)2.84.1
日間精度 (RSD%)4.25.9
回収率 (%)97.3 ± 3.194.8 ± 4.5
Matrix Effect (%)-8.2-12.5

サポニン分析 (Chianese et al. 2019)

トリテルペンサポニンには特別なイオン化条件とフラグメンテーション戦略が必要です。

イレックスサポニンのMRMトランジション

Saponin[M-H]⁻ (m/z)Main Fragment (m/z)CE (eV)
Ilexsaponin A927.5455.3 (Aglycone)35
Ilexsaponin B911.5455.3 (Aglycone)35
Ursolic acid455.3407.3 [M-H-CO₂]⁻25
Oleanolic acid455.3407.3 [M-H-CO₂]⁻25

揮発性化合物のGC-MS

ガスクロマトグラフィー-質量分析は、Guayusaの揮発性芳香成分の分析に使用されます。

Headspace-SPME-GC-MS

SPME条件

  • ファイバー:DVB/CAR/PDMS(50/30 μm、Supelco)
  • サンプル温度:60°C
  • 抽出時間:30分
  • 脱着:250°C、GCインジェクターで3分

GC-MSパラメータ

パラメータ値
カラムDB-5MS (30 m × 0.25 mm, 0.25 μm)
Carrier GasHelium, 1.0 mL/min (constant)
Injector Temperature250°C
Injection ModeSplitless
オーブンプログラム40°C (3 min) → 5°C/min → 250°C (5 min)
Transfer Line280°C
Ion SourceEI, 70 eV, 230°C
スキャン範囲m/z 35-350

同定された揮発性化合物

化合物RT (min)Relative Abundance (%)Odor Note
Linalool18.312.4Floral, citrus-like
α-Terpineol19.78.2Lilac, woody
Geraniol21.26.5Rose-like
β-Ionone28.45.1Violet, woody
Hexanal8.94.8Grassy, green
(E)-2-Hexenal10.23.9Green, leafy

分光法的手法

UV-Vis Spectrophotometry

Folin-Ciocalteu法（総フェノール含量）

Kolorimetrische Bestimmung des Gesamtpolyphenolgehalts.

プロトコル
  1. 0.5 mL 抽出物（または標準）を15 mLチューブに
  2. Add 2.5 mL Folin-Ciocalteu reagent (diluted 1:10)
  3. Incubate 2 min at RT
  4. Add 2 mL Na₂CO₃ solution (75 g/L), mix
  5. Incubate 15 min at 50°C
  6. Cool to RT
  7. 750 nmで吸光度を測定
校正
  • 標準:没食子酸
  • 濃度範囲:10-90 mg/L
  • 直線性(R²):0.9997
  • 結果:mg没食子酸当量(GAE)/g乾燥重量

NMR Spectroscopy

分離された化合物の構造解明のための核磁気共鳴分光法。

標準条件

パラメータ¹H-NMR¹³C-NMR
Frequency600 MHz150 MHz
SolventCD₃OD, DMSO-d₆CD₃OD, DMSO-d₆
Temperature25°C25°C
試料量1-5 mg5-20 mg
測定時間10-30 min2-8 h

2D-NMR Techniques

  • COSY:¹H-¹H相関
  • HSQC:¹H-¹³C相関(1結合)
  • HMBC:¹H-¹³C相関(2-3結合)
  • NOESY:プロトンの空間的近接性

抗酸化能

ORAC（酸素ラジカル吸収能）

抗酸化能を測定するための蛍光ベースの方法。

プロトコル（96ウェルマイクロプレート）

  1. Prepare Reagents:
    • Fluorescein: 1 μM in Phosphatpuffer (pH 7,4)
    • AAPH: 250 mM in phosphate buffer
    • Trolox standards: 10-200 μM
  2. Pipetting Scheme:
    • 150 μL Fluorescein in jedes Well
    • 25 μL 試料/標準/ブランク
    • Incubation 15 min at 37°C
    • Add 25 μL AAPH (start of reaction)
  3. Measurement:
    • Fluoreszenz alle 2 min für 120 min
    • Excitation: 485 nm, Emission: 520 nm
    • Temperature: 37°C
  4. Calculation:
    • AUC (Area Under Curve) für jede Probe
    • Net AUC = AUC_sample - AUC_blank
    • Result: μmol Trolox equivalents / g

典型的なORAC値

試料ORAC (μmol TE/g DW)
Guayusa (fresh)127.8 ± 8.3
Guayusa (fermented)101.2 ± 7.1
Green Tea80-100
Yerba Mate90-120

DPPH Assay

Schnelle spektrophotometrische Methode.

マイクロプレートプロトコル

  1. 250 μL DPPH solution (in methanol) in each well
  2. 2 μL 試料/標準を添加
  3. Incubate 50 min at RT in the dark
  4. 515 nmで吸光度を測定
  5. Calculation: % inhibition = [(A_blank - A_sample) / A_blank] × 100

FRAP（鉄還元抗酸化力）

Misst die Reduktionskraft von Antioxidantien.

FRAP Reagent

  • Acetate buffer (300 mM, pH 3.6): 25 mL
  • TPTZ (10 mM in 40 mM HCl): 2.5 mL
  • FeCl₃·6H₂O (20 mM): 2.5 mL
  • Mix fresh before use, warm to 37°C

Procedure

  1. 10 μL 試料 + 300 μL FRAP試薬
  2. Incubate 4 min at 37°C
  3. 593 nmで吸光度を測定
  4. FeSO₄で校正 (100-1000 μM)
  5. Result: μmol Fe²⁺ equivalents / g

方法の妥当性確認

Validierung analytischer Methoden nach ICH Q2(R1) Richtlinien.

バリデーションパラメータ

1. Specificity/Selectivity

  • 方法が目標分析物のみを測定することを証明
  • マトリックスや他の化合物による干渉なし
  • テスト:ブランク、標準、サンプルの分析;ピーク純度を確認

2. 線形性

CriterionRequirementGuayusa-方法
Correlation Coefficient (R²)≥ 0.9950.9992-0.9999
校正点数≥ 56-8
濃度範囲目標濃度の80-120%50-150%
ResidualsRandomly distributed✓

3. 精度

Type条件RSD RequirementGuayusa Data
RepeatabilitySame day, same analyst< 5%1.2-4.6%
中間精度Different days< 10%3.3-5.9%
ReproducibilityDifferent laboratories< 15%Not tested

4. Accuracy

  • 回収率:90-110%(主要成分の場合)
  • 方法:スパイク回収実験
  • グアユサデータ:88.5-98.7%

5. 検出限界および定量限界

パラメータDefinitionCalculation
LOD (検出限界)Lowest detectable amount3.3 × σ / S
LOQ (Limit of Quantification)Lowest quantifiable amount10 × σ / S

σ = 応答の標準偏差、S = キャリブレーション曲線の傾き

6. Robustness

小さな変動に対する方法の不感受性：

  • pH of mobile phase (±0.2)
  • Flow rate (±10%)
  • Column temperature (±5°C)
  • Wavelength (±2 nm)
  • Different columns (same type, different batches)

7. Stability

Stability Type条件Guayusa Results
Autosampler Stability4°C, 48 hStable (<5% degradation)
Bench-top StabilityRT, 6 hPolyphenols: -8%, Caffeine: stable
Freeze-Thaw Stability3 cyclesStable (<10% degradation)
Long-term Stability-20°C, 6 monthsStable (<10% degradation)

品質管理

体系的なQC措置によるデータ品質の保証。

QC Samples

QC Type濃度FrequencyAcceptance Criterion
Blank0Each sequence (start)No peaks at analyte RT
LLOQ (Lower LOQ)LOQEach sequence名目濃度の80-120%
QC Low3 × LOQEvery 10 samples85-115%
QC Mid範囲の中央Every 10 samples85-115%
QC High80% of upper limitEvery 10 samples85-115%

システム適合性試験（SST）

各シーケンスの前に実施：

パラメータRequirementCalculation
保持時間の再現性RSD &lt; 1%標準の6回注入
Peak area reproducibilityRSD &lt; 2%標準の6回注入
Resolution (Rs)&gt; 1.5Rs = 2(tR2 - tR1) / (w1 + w2)
Tailing factor (Tf)&lt; 2.0Tf = (a + b) / 2a
Theoretical plate number (N)&gt; 2000N = 16 (tR / w)²

Documentation

  • サンプル調製:日付、分析者、バッチ番号を含むプロトコル
  • 機器ログブック:メンテナンス、カラム交換、問題
  • 校正曲線:方程式、R²、残差プロット
  • QCチャート:トレンド監視のためのLevey-Jennings図
  • 規格外(OOS):逸脱の文書化と調査

参照材料

標準PuritySourceStorage
カフェイン≥ 99%Sigma-AldrichRT, dry
クロロゲン酸(5-CQA)≥ 95%Sigma-Aldrich-20°C, dry
Rutin≥ 94%Sigma-Aldrich-20°C, dry
エピカテキン≥ 98%Sigma-Aldrich-20°C, dry
Trolox≥ 97%FlukaRT, dry

最新の手法と研究（2024–2026）

近年（2024–2026）の研究では、ワークフローや「グリーン」手法の改善が中心です。クロロゲン酸プロファイリング、untargeted metabolomics、抽出・精製技術などが発展しています。

  • 方法論: クロロゲン酸ワークフロー（J Chromatogr A 2026, PMID: 41604851）: HPLC-UV（5-CQA）+ LC-MS/MS、feature-based molecular networking、ケモメトリクス。
  • 方法論: untargeted metabolomics（Food Chemistry 2026, PMID: 41643380）: GC-EI-MS、205代謝物をアノテーション; 葉齢と光条件が主要因。
  • 加工/方法論: 超臨界アンチソルベント（Molecules 2024, PMID: 39598698）: クロロゲン酸を濃縮し、カフェインを選択的に <1% m/m; PVPによるカプセル化。
  • In press: 圧縮流体による持続可能な抽出（DOI: 10.1016/j.supflu.2025.106801）。
  • In press: 機能性成分のための亜臨界水抽出（DOI: 10.1016/j.scp.2026.102338）。
方法論

Garzón, T., et al. (2026)

Integrated HPLC-UV validation and LC-MS/MS optimization with molecular networking

molecular networking

MS/MS スペクトルを類似度で結び付けてネットワーク化する計算手法（GNPS など）。関連する化合物ファミリーを可視化し、注釈付けを支援する。

Mehr Infos
and chemometrics for advanced characterization of chlorogenic acids in Ilex guayusa

PMID: 41604851. DOI: 10.1016/j.chroma.2026.466732

  • 研究デザイン: 5‑CQAのHPLC‑UV定量を検証し、UPLC‑MS/MS（FastDDA）の最適化とRAWデータ統合、feature-based molecular networking、ケモメトリクス（PCA/volcano/HCA）を組み合わせた統合ワークフロー。
  • 主な結果: 5‑CQAでLOQ 0.25 mg/L、r²≈0.998。RAWデータ統合で特徴量が43%増加。成分差の主要因は産地、次いで日照条件と植物年齢。
  • 補足: QC/標準化では、ターゲット（例：5‑CQA）と非ターゲットプロファイルを併用し、産地・光・樹齢をメタデータとして記録すると比較可能性が高まります。
方法論

Pastuña-Fasso, J.V., et al. (2026)

Influence of plant age and sunlight exposure on the volatile profile and metabolomic pathways of Ilex guayusa leaves used in the traditional Amazonian beverage

PMID: 41643380. DOI: 10.1016/j.foodchem.2026.148238

  • 研究デザイン: 水抽出物のuntargeted metabolomics（GC‑EI‑MS）。複数ツールでデコンボリューション/アノテーションし、樹齢と光/陰条件を比較。
  • 主な結果: 205代謝物をアノテーション。光条件でフェノールが高く、陰条件で脂質が優勢。経路解析でフェニルプロパノイド、チロシン代謝、脂肪酸分解などへの影響が示唆。
  • 補足: 方法・組成研究ですが標準化に重要です。樹齢や遮光管理で成分クラスが変わるため、制御または記録が推奨されます。
方法論

Meneses, M.Á., et al. (2024)

Green Processing of Ilex guayusa: Antioxidant Concentration and Caffeine Reduction Using Encapsulation by Supercritical Antisolvent Process

PMID: 39598698. DOI: 10.3390/molecules29225309

  • 研究デザイン: 超臨界アンチソルベント（SAE）でエタノール抽出物を分画（80–150 bar、35–45℃）。PVPによる共沈/カプセル化（1:1～1:2, w/w）も検討。
  • 主な結果: 120 bar/45℃で最適化：クロロゲン酸が43.02→237 mg/gへ濃縮、カフェインは<1%（w/w）に低減。PVPで収率が>2倍となりマイクロ粒子を形成。
  • 補足: 飲用茶ではなく原料/加工の文脈です。低カフェイン・高ポリフェノール原料の設計や分析の前提（製品タイプ）に影響します。
In press

In press (2026)

Towards sustainable extraction of bioactive compounds from guayusa (Ilex guayusa): A comparative study on compressed fluids’ performance

DOI: 10.1016/j.supflu.2025.106801

  • 研究デザイン: In press：圧縮流体を用いた持続可能な抽出法の比較研究。
  • 主な結果: タイトル情報では、圧縮流体アプローチのプロセス性能を比較。詳細はDOIの論文を参照。
  • 補足: 自由に参照できるabstractがないため、ここでは概要のみを記載しています。入手でき次第、条件や指標を追記できます。
In press

In press (2026)

Subcritical water extraction of Ilex guayusa for regulatory-compliant neuro-metabolic functional ingredients

DOI: 10.1016/j.scp.2026.102338

  • 研究デザイン: In press：亜臨界水抽出により、規制適合の機能性成分を得ることを目的とした研究。
  • 主な結果: タイトル情報では、亜臨界条件の水を「グリーン」溶媒として用い、規制適合を重視。具体的な条件/ターゲットは論文参照。
  • 補足: abstract未公開のため、タイトルに基づく慎重な分類に留めています。情報が得られ次第、詳細を追記します。

Wichtige Literatur für Analytiker

  • García-Ruiz, A., et al. (2017). Guayusa (Ilex guayusa L.) new tea: phenolic and carotenoid composition and antioxidant capacity. J Sci Food Agric, 97(12), 3929-3936. [Umfassende HPLC-DAD-ESI/MSn-Methode]
  • Krieger, D.R., et al. (2016). The safety, pharmacokinetics, and nervous system effects of two natural sources of caffeine. Clin Transl Sci, 9(5), 246-251. [LC-MS/MS für Koffein-Pharmakokinetik]
  • Stinco, C.M., et al. (2016). RRLC-DAD-APCI-MS analysis of carotenoids. Food Chem, 211, 876-883. [Carotinoid-Analytik]
  • Chianese, G., et al. (2019). Phytochemical analysis of Ilex guayusa. Il Farmaco, 74(1), 85-93. [Saponin-Charakterisierung mit NMR und MS]
  • ICH Q2(R1). (2005). 分析手順のバリデーション: テキストと方法論. [バリデーションガイドライン]

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参照

科学

化学組成

Detaillierte Phytochemie der Inhaltsstoffe

科学

科学的研究

Forschungsmethoden und Ergebnisse

農業

栽培と加工

Einfluss von Anbau auf Inhaltsstoffgehalt