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分析方法

关于Ilex guayusa植物化学分析的专业人员综合方法学详情

要点
关键点一览：
  • 概述
  • 样品制备
  • HPLC方法
  • LC-MS/MS方法
  • 挥发性化合物的GC-MS

本页面面向科学家、分析师和专业人员。它包含有关Guayusa成分分析的详细方法学信息。

分析方法概述

Ilex guayusa的植物化学特征需要结合多种分析技术。方法的选择取决于目标化合物、基质和所需的灵敏度。

方法目标化合物LOD分析时间成本
HPLC-DAD多酚、咖啡因0.1-1 μg/mL30-60 min€€
HPLC-DAD-ESI/MSn多酚(结构解析)0.01-0.1 μg/mL45-90 min€€€
LC-MS/MS (QqQ)生物碱、皂苷0.001-0.01 μg/mL15-30 min€€€€
GC-MS挥发性化合物0.01-0.1 ng/mL30-45 min€€€
UV-Vis Spectroscopy总多酚(TPC)1-10 μg/mL5-10 min€
NMR结构解析1-10 mg1-4 h€€€€€

样品制备

样品制备对于获得可重复和准确的结果至关重要。Guayusa叶子含有高浓度的多酚，容易氧化。

多酚分析标准协议 (García-Ruiz et al. 2017)

材料

  • Freeze-dried guayusa leaves (ground, <0.5 mm)
  • 提取溶液：甲醇/水 (70:30, v/v) + 1%甲酸
  • 0.45 μm PVDF filter (Millex HV13, Millipore)
  • Ultrasonic bath (40 kHz)
  • Centrifuge (9,500 × g)

协议

  1. 称量: 100 mg 冻干粉末于15 mL Falcon管中
  2. 提取 1: 加入1 mL 提取液，涡旋混合 (30 s)
  3. 超声波 1: 在室温下超声波浴60 min
  4. 孵育: 4°C 过夜
  5. 超声波 2: 再次在超声波浴60 min
  6. 离心: 9.500 × g, 5 min, 室温
  7. 过滤: 上清液通过0.45 μm PVDF过滤器
  8. 储存: 在4°C黑暗中，分析前最多48小时

回收率

化合物类别回收率 (%)RSD (%)
绿原酸类94.2 ± 3.13.3
黄酮醇类91.8 ± 4.24.6
儿茶素类88.5 ± 5.15.8
咖啡因98.7 ± 1.21.2

类胡萝卜素提取 (Stinco et al. 2016)

协议

  1. 称量: 10 mg 冻干粉末
  2. 去除水分: 1 mL MilliQ水，涡旋混合，离心 (18.000 × g, 3 min)，弃去
  3. 提取 1: 1 mL 正己烷/丙酮 (1:1, v/v)，涡旋混合，离心 (18.000 × g, 3 min)
  4. 提取 2: 500 μL 正己烷/丙酮，涡旋混合，离心
  5. 合并: 合并有机相
  6. 皂化: 甲醇KOH (30 g/100 mL)，在室温下黑暗中1小时
  7. 洗涤: 用水至pH中性
  8. 蒸发: 真空浓缩器, <30°C
  9. 溶解: 于100 μL 乙酸乙酯中
  10. 储存: 在N₂下于-20°C

关键因素

  • 氧化: 多酚快速氧化 → 甲酸作为抗氧化剂，储存于4°C黑暗中
  • 光: 类胡萝卜素对光不稳定 → 在昏暗光线下操作，琥珀色玻璃
  • 温度:酶可能降解多酚→冷冻干燥或立即提取
  • pH值:影响稳定性和提取→多酚的最佳pH为2-3

HPLC方法

HPLC-DAD für Quantifizierung

高效液相色谱与二极管阵列检测器 text_563是多酚和咖啡因定量的标准方法。

Instrument Setup (García-Ruiz et al. 2017)

  • 系统：Agilent 1220 Infinity LC
  • 泵:二元梯度泵
  • 自动进样器:进样量20 μL
  • 柱温箱:30°C
  • 检测器:DAD,200-600 nm

色谱条件

参数值
色谱柱Luna C18 (25 cm × 4.6 mm, 5 μm, Phenomenex)
保护柱C18, 4 × 3 mm
流动相AWater + 0.1% Formic Acid
流动相BMethanol + 0.1% Formic Acid
流速1.0 mL/min
进样量20 μL
柱温30°C
运行时间60 min

梯度程序

时间 (min)%A (Water)%B (Methanol)
0955
59010
158020
257030
356040
454060
502080
55595
60955

检测波长

化合物类别λmax (nm)定量波长
羟基肉桂酸(绿原酸类)325330 nm
黄酮醇类(槲皮素、山奈酚)365360 nm
儿茶素类280280 nm
咖啡因272272 nm
花青素(如存在)520520 nm

校准

使用标准物质进行外部校准：

标准浓度范围 (μg/mL)R²线性
绿原酸(5-CQA)1-1000.9998优秀
芦丁(槲皮素-3-O-芸香糖苷)0.5-500.9996优秀
表儿茶素0.5-500.9992优秀
咖啡因5-5000.9999优秀

HPLC-DAD-ESI/MSn für Strukturaufklärung

HPLC与质谱联用通过碎片化模式实现未知化合物的鉴定。

MS参数 (García-Ruiz et al. 2017)

参数值
Mass spectrometerAgilent Ion Trap (G2445A)
IonizationElectrospray (ESI)
ModeNegative ionization
Capillary temperature350°C
Capillary voltage4 kV
Nebulizer pressure65 psi
N₂ flow rate11 L/min
扫描范围m/z 100-1200
Collision gasHelium
Collision energy0.3-2.0 V (ramping)

Example: Identification of Quercetin-3-O-hexoside

  • 保留时间:32.4分钟
  • UV光谱:λmax 256,355 nm(黄酮醇的典型特征)
  • [M-H]⁻: m/z 463
  • MS²(463):m/z 301 [M-H-162]⁻(己糖损失)
  • MS³(301):m/z 179,151(槲皮素的典型碎片模式)
  • 鉴定:槲皮素-3-O-葡萄糖苷或-半乳糖苷

Characteristic Fragmentations

化合物类别Characteristic Neutral LossesTypical Fragments
绿原酸类-162 (quinic acid), -176 (caffeoylquinic acid)m/z 191 (quinic acid), 179 (caffeic acid)
Quercetin Glycosides-162 (Hexose), -146 (Rhamnose), -308 (Rutinoside)m/z 301 (Quercetin Aglycone)
Kaempferol Glycosides-162 (Hexose), -146 (Rhamnose)m/z 285 (Kaempferol Aglycone)
儿茶素类-152 (Gallate)m/z 289 (Epicatechin), 139 (Gallic acid)

LC-MS/MS方法 (三重四极杆)

对于生物碱和皂苷的高灵敏度定量，使用LC-MS/MS与三重四极杆质谱仪在多反应监测（MRM）模式下进行。

咖啡因定量(Krieger et al. 2016)

LC参数

参数值
色谱柱Acquity UPLC BEH C18 (50 mm × 2.1 mm, 1.7 μm)
流动相A0.1% formic acid in water
流动相B0.1% formic acid in acetonitrile
流速0.4 mL/min
进样量5 μL
运行时间5 min

MS/MS参数 (MRM模式)

AnalytePrecursor Ion (m/z)Product Ion (m/z)Collision Energy (eV)LOQ (ng/mL)
咖啡因195.1 [M+H]⁺138.1 (Quantifier)205
咖啡因195.1 [M+H]⁺110.1 (Qualifier)25-
Theobromine181.1 [M+H]⁺138.11810
Paraxanthine (IS)181.1 [M+H]⁺124.122-

方法验证

参数咖啡因Theobromine
线性 (R²)0.99980.9995
LOD (ng/mL)1.53.0
LOQ (ng/mL)5.010.0
日内精密度 (RSD%)2.84.1
日间精密度 (RSD%)4.25.9
回收率 (%)97.3 ± 3.194.8 ± 4.5
Matrix Effect (%)-8.2-12.5

皂苷分析 (Chianese et al. 2019)

三萜皂苷需要特殊的电离条件和碎片化策略。

冬青皂苷的MRM转换

Saponin[M-H]⁻ (m/z)Main Fragment (m/z)CE (eV)
Ilexsaponin A927.5455.3 (Aglycone)35
Ilexsaponin B911.5455.3 (Aglycone)35
Ursolic acid455.3407.3 [M-H-CO₂]⁻25
Oleanolic acid455.3407.3 [M-H-CO₂]⁻25

GC-MS用于挥发性化合物

气相色谱-质谱用于分析Guayusa中的挥发性芳香成分。

Headspace-SPME-GC-MS

SPME-Bedingungen

  • 纤维:DVB/CAR/PDMS(50/30 μm,Supelco)
  • 样品温度:60°C
  • 提取时间:30分钟
  • 解吸:250°C,在GC进样器中3分钟

GC-MS参数

参数值
色谱柱DB-5MS (30 m × 0.25 mm, 0.25 μm)
Carrier GasHelium, 1.0 mL/min (constant)
Injector Temperature250°C
Injection ModeSplitless
炉程序40°C (3 min) → 5°C/min → 250°C (5 min)
Transfer Line280°C
Ion SourceEI, 70 eV, 230°C
扫描范围m/z 35-350

识别的挥发性化合物

化合物RT (min)Relative Abundance (%)Odor Note
Linalool18.312.4Floral, citrus-like
α-Terpineol19.78.2Lilac, woody
Geraniol21.26.5Rose-like
β-Ionone28.45.1Violet, woody
Hexanal8.94.8Grassy, green
(E)-2-Hexenal10.23.9Green, leafy

光谱方法

UV-Vis Spectrophotometry

Folin-Ciocalteu-方法 (总酚含量)

Kolorimetrische Bestimmung des Gesamtpolyphenolgehalts.

协议
  1. 0.5 mL提取物（或标准品）在15 mL试管中
  2. Add 2.5 mL Folin-Ciocalteu reagent (diluted 1:10)
  3. Incubate 2 min at RT
  4. Add 2 mL Na₂CO₃ solution (75 g/L), mix
  5. Incubate 15 min at 50°C
  6. Cool to RT
  7. 在750 nm处测量吸光度
校准
  • 标准:没食子酸
  • 浓度范围:10-90 mg/L
  • 线性度(R²):0.9997
  • 结果:mg没食子酸当量(GAE)/g干重

NMR Spectroscopy

核磁共振光谱用于分离化合物的结构解析。

标准条件

参数¹H-NMR¹³C-NMR
Frequency600 MHz150 MHz
SolventCD₃OD, DMSO-d₆CD₃OD, DMSO-d₆
Temperature25°C25°C
样品量1-5 mg5-20 mg
测量时间10-30 min2-8 h

2D-NMR Techniques

  • COSY:¹H-¹H相关
  • HSQC:¹H-¹³C相关(1键)
  • HMBC:¹H-¹³C相关(2-3键)
  • NOESY:质子的空间接近度

抗氧化能力

ORAC (氧自由基吸收能力)

基于荧光的方法用于测量抗氧化能力。

协议 (96孔微孔板)

  1. Prepare Reagents:
    • Fluorescein: 1 μM in Phosphatpuffer (pH 7,4)
    • AAPH: 250 mM in phosphate buffer
    • Trolox standards: 10-200 μM
  2. Pipetting Scheme:
    • 150 μL Fluorescein in jedes Well
    • 25 μL样品/标准品/空白
    • Incubation 15 min at 37°C
    • Add 25 μL AAPH (start of reaction)
  3. Measurement:
    • Fluoreszenz alle 2 min für 120 min
    • Excitation: 485 nm, Emission: 520 nm
    • Temperature: 37°C
  4. Calculation:
    • AUC (Area Under Curve) für jede Probe
    • Net AUC = AUC_sample - AUC_blank
    • Result: μmol Trolox equivalents / g

典型ORAC值

样品ORAC (μmol TE/g DW)
Guayusa (fresh)127.8 ± 8.3
Guayusa (fermented)101.2 ± 7.1
Green Tea80-100
Yerba Mate90-120

DPPH Assay

Schnelle spektrophotometrische Methode.

微孔板协议

  1. 250 μL DPPH solution (in methanol) in each well
  2. 加入2 μL样品/标准品
  3. Incubate 50 min at RT in the dark
  4. 在515 nm处测量吸光度
  5. Calculation: % inhibition = [(A_blank - A_sample) / A_blank] × 100

FRAP (铁还原抗氧化能力)

Misst die Reduktionskraft von Antioxidantien.

FRAP Reagent

  • Acetate buffer (300 mM, pH 3.6): 25 mL
  • TPTZ (10 mM in 40 mM HCl): 2.5 mL
  • FeCl₃·6H₂O (20 mM): 2.5 mL
  • Mix fresh before use, warm to 37°C

Procedure

  1. 10 μL样品 + 300 μL FRAP试剂
  2. Incubate 4 min at 37°C
  3. 在593 nm处测量吸光度
  4. 用FeSO₄校准（100-1000 μM）
  5. Result: μmol Fe²⁺ equivalents / g

方法验证

Validierung analytischer Methoden nach ICH Q2(R1) Richtlinien.

验证参数

1. Specificity/Selectivity

  • 证明该方法仅测量目标分析物
  • 无基质或其他化合物的干扰
  • 测试:分析空白、标准、样品;检查峰纯度

2. 线性

CriterionRequirementGuayusa-方法
Correlation Coefficient (R²)≥ 0.9950.9992-0.9999
校准点数量≥ 56-8
浓度范围目标浓度的80-120%50-150%
ResidualsRandomly distributed✓

3. 精密度

Type条件RSD RequirementGuayusa Data
RepeatabilitySame day, same analyst< 5%1.2-4.6%
中间精密度Different days< 10%3.3-5.9%
ReproducibilityDifferent laboratories< 15%Not tested

4. Accuracy

  • 回收率:90-110%(主要成分)
  • 方法:加标回收实验
  • 瓜尤萨数据:88.5-98.7%

5. 检测限和定量限

参数DefinitionCalculation
LOD (检测限)Lowest detectable amount3.3 × σ / S
LOQ (Limit of Quantification)Lowest quantifiable amount10 × σ / S

σ = 响应的标准偏差，S = 校准曲线的斜率

6. Robustness

方法对小变动的不敏感性：

  • pH of mobile phase (±0.2)
  • Flow rate (±10%)
  • Column temperature (±5°C)
  • Wavelength (±2 nm)
  • Different columns (same type, different batches)

7. Stability

Stability Type条件Guayusa Results
Autosampler Stability4°C, 48 hStable (<5% degradation)
Bench-top StabilityRT, 6 hPolyphenols: -8%, Caffeine: stable
Freeze-Thaw Stability3 cyclesStable (<10% degradation)
Long-term Stability-20°C, 6 monthsStable (<10% degradation)

质量控制

通过系统的QC措施确保数据质量。

QC Samples

QC Type浓度FrequencyAcceptance Criterion
Blank0Each sequence (start)No peaks at analyte RT
LLOQ (Lower LOQ)LOQEach sequence标称浓度的80-120%
QC Low3 × LOQEvery 10 samples85-115%
QC Mid范围的中间Every 10 samples85-115%
QC 高80% of upper limitEvery 10 samples85-115%

系统适用性测试 (SST)

每个序列前执行：

参数RequirementCalculation
保留时间再现性RSD &lt; 1%6次标准品注射
Peak area reproducibilityRSD &lt; 2%6次标准品注射
Resolution (Rs)&gt; 1.5Rs = 2(tR2 - tR1) / (w1 + w2)
Tailing factor (Tf)&lt; 2.0Tf = (a + b) / 2a
Theoretical plate number (N)&gt; 2000N = 16 (tR / w)²

Documentation

  • 样品制备:包含日期、分析员、批号的协议
  • 仪器日志:维护、柱更换、问题
  • 校准曲线:方程、R²、残差图
  • QC图表:用于趋势监测的Levey-Jennings图
  • 超出规格(OOS):偏差的记录和调查

参考材料

标准PuritySourceStorage
咖啡因≥ 99%Sigma-AldrichRT, dry
绿原酸(5-CQA)≥ 95%Sigma-Aldrich-20°C, dry
Rutin≥ 94%Sigma-Aldrich-20°C, dry
表儿茶素≥ 98%Sigma-Aldrich-20°C, dry
Trolox≥ 97%FlukaRT, dry

最新方法与研究（2024–2026）

近年（2024–2026）的工作主要改进了工作流与绿色工艺：绿原酸谱分析、非靶向代谢组，以及提取与纯化技术。

  • 方法学： 绿原酸工作流（J Chromatogr A 2026, PMID: 41604851）：HPLC-UV（5-CQA）+ LC-MS/MS、基于特征的分子网络与化学计量学。
  • 方法学： 非靶向代谢组（Food Chemistry 2026, PMID: 41643380）：GC-EI-MS，注释 205 种代谢物；叶龄与光照是重要影响因素。
  • 加工/方法学： 超临界抗溶剂（Molecules 2024, PMID: 39598698）：浓缩绿原酸并选择性降低咖啡因至 <1% m/m；PVP 包封。
  • 待刊： 压缩流体的可持续提取（DOI: 10.1016/j.supflu.2025.106801）。
  • 待刊： 用亚临界水提取获得功能性成分（DOI: 10.1016/j.scp.2026.102338）。
方法学

Garzón, T., et al. (2026)

Integrated HPLC-UV validation and LC-MS/MS optimization with molecular networking and chemometrics for advanced characterization of chlorogenic acids in Ilex guayusa

PMID: 41604851. DOI: 10.1016/j.chroma.2026.466732

  • 研究设计： 整合工作流：验证 HPLC‑UV 定量 5‑CQA，并优化 UPLC‑MS/MS（FastDDA）与原始数据合并；结合基于特征的分子网络与化学计量学（PCA/volcano/HCA）。
  • 主要发现： 5‑CQA 的 LOQ 为 0.25 mg/L，r²≈0.998。原始数据合并使特征数增加 43%。成分差异主要由产地驱动，其次为光照与植株年龄。
  • 解读： 质量控制建议：靶向指标（如 5‑CQA）与非靶向谱图/网络分析结合，并记录产地、光照/遮阴与年龄等元数据，以提升批次与研究间的可比性。
方法学

Pastuña-Fasso, J.V., et al. (2026)

Influence of plant age and sunlight exposure on the volatile profile and metabolomic pathways of Ilex guayusa leaves used in the traditional Amazonian beverage

PMID: 41643380. DOI: 10.1016/j.foodchem.2026.148238

  • 研究设计： 非靶向代谢组：水提物 GC‑EI‑MS；用 MZmine、MS‑DIAL、eRah、MSHub/GNPS 等多工具去卷积/注释；比较植株年龄与光照 vs 遮阴。
  • 主要发现： 注释 205 种代谢物；光照下酚类更高，遮阴下脂类占优势；通路分析提示对苯丙烷、酪氨酸代谢与脂肪酸降解等的影响。
  • 解读： 提示栽培参数（年龄、遮阴）在分析上可见。用于标准化时，建议尽量控制或至少记录这些因素。
方法学

Meneses, M.Á., et al. (2024)

Green Processing of Ilex guayusa: Antioxidant Concentration and Caffeine Reduction Using Encapsulation by Supercritical Antisolvent Process

PMID: 39598698. DOI: 10.3390/molecules29225309

  • 研究设计： 超临界抗溶剂（SAE）分级：乙醇提取物（80–150 bar，35–45°C）；并可用 PVP 共沉淀/包封（1:1–1:2, w/w）。
  • 主要发现： 优化（120 bar/45°C）：绿原酸 43.02 → 237 mg/g；咖啡因选择性降低到 <1% m/m；PVP 提高产率（>2×）并促进微粒形成。
  • 解读： 该类“绿色”加工可获得低咖啡因、高多酚原料。对分析很关键：这类产品与传统叶片冲泡在组成与指标上不可直接类比。
待刊

In press (2026)

Towards sustainable extraction of bioactive compounds from guayusa (Ilex guayusa): A comparative study on compressed fluids’ performance

DOI: 10.1016/j.supflu.2025.106801

  • 研究设计： 待刊：比较压缩流体（compressed fluids）在可持续提取瓜尤萨活性成分方面的工艺表现。
  • 主要发现： 从标题推断：比较工艺性能（如产率/选择性等）；具体参数与结果详见 DOI 论文。
  • 解读： 因缺少可自由访问摘要，这里仅提供总体分类；获得更多信息后可补充具体工艺窗口与指标。
待刊

In press (2026)

Subcritical water extraction of Ilex guayusa for regulatory-compliant neuro-metabolic functional ingredients

DOI: 10.1016/j.scp.2026.102338

  • 研究设计： 待刊：亚临界水提取瓜尤萨以获得符合监管要求的功能性成分。
  • 主要发现： 从标题推断：聚焦亚临界水作为绿色溶剂与合规性；具体目标与参数见 DOI 论文。
  • 解读： 因缺少可自由访问摘要，这里仅做谨慎的标题级分类；后续可补充更具体的过程参数与指标。

Wichtige Literatur für Analytiker

  • García-Ruiz, A., et al. (2017). Guayusa (Ilex guayusa L.) new tea: phenolic and carotenoid composition and antioxidant capacity. J Sci Food Agric, 97(12), 3929-3936. [Umfassende HPLC-DAD-ESI/MSn-Methode]
  • Krieger, D.R., et al. (2016). The safety, pharmacokinetics, and nervous system effects of two natural sources of caffeine. Clin Transl Sci, 9(5), 246-251. [LC-MS/MS für Koffein-Pharmakokinetik]
  • Stinco, C.M., et al. (2016). RRLC-DAD-APCI-MS analysis of carotenoids. Food Chem, 211, 876-883. [Carotinoid-Analytik]
  • Chianese, G., et al. (2019). Phytochemical analysis of Ilex guayusa. Il Farmaco, 74(1), 85-93. [Saponin-Charakterisierung mit NMR und MS]
  • ICH Q2(R1). (2005). 分析程序的验证：文本和方法学。 [验证指南]

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另见

科学

化学成分

Detaillierte Phytochemie der Inhaltsstoffe

科学

科学研究

Forschungsmethoden und Ergebnisse

农业

种植与加工

Einfluss von Anbau auf Inhaltsstoffgehalt